Położony przy placu Matejki. W 1185 r. książę Kazimierz Sprawiedliwy i biskup krakowski Gedko sprowadzili do Krakowa relikwie św. Floriana i ufundowali kościół. W XV w. świątynię przebudowano w stylu gotyckim na trójnawową halę z prostokątnym prezbiterium. Budowla spłonęła w 1655 r., podczas najazdu szwedzkiego. W 1684 r. ukończono odbudowę kościoła, do której przyczynił się znacznie biskup Andrzej Trzebicki. Powstała obecna trójnawowa bazylika z barokowym dwuwieżowym korpusem i gotyckim trójbocznym prezbiterium.
Po zniszczeniach w 1755 i 1768 r. powstała nowa fasada kościoła z fundacji księdza Antoniego Krzanowskiego, według projektu krakowskiego architekta Macieja Czapigowskiego. 


W centrum fasady umieszczono rzeźbę św. Floriana wykonaną przez śląskiego artystę F. J. Mangoldta. W 1836 r. wieże nakryto nowymi hełmami. W latach 1902 - 1904 przebudowano fasadę według projektu Józefa Kryłowskiego, między innymi podwyższono wieże o jedną kondygnację, dano nowe hełmy, podwyższono kruchtę. Do naw bocznych dobudowane kaplice. Wnętrze kościoła ozdobiono w 1907 r. neorokokową stiukową dekoracją (J. Szczepkowski).
W ołtarzu glównym znajduje się cenny obraz przedstawiający św. Floriana, namalowany w 1686 r. przez Jana Tricjusza, nadwornego artystę króla Jana III Sobieskiego. W kaplicy bocznej zwraca uwagę późnogotycki ołtarz św. Jana Chrzciciela (pocz. XVI w.), a w kaplicy św. Jana Kantego obraz tego świętego namalowany przez Tadeusza Kuntze Konicza i chorągiew kanonizacyjna (1767).
Kościołem opiekowali się do 1578 r. królowie polscy, a później Akademia Krakowska. Tutaj rozpoczynała się tzw. Droga Królewska, trasa uroczystych wjazdów i pogrzebów monarszych, wiodąca na Wawel.